|
 |
|
По Материалам XIХ Международной научной конференции диатомологов «Диатомовые водоросли: фундаментальные и прикладные исследования», посвященной 120-летию со дня рождения А.П. Жузе Биотехнология и практическое использование водорослей Криоконсервация диатомовой водоросли Melosira sp.
Маркина Ж.В., Борода А.В. Zhanna V. Markina, Andrei V. Boroda
Национальный научный центр морской биологии имени А.В. Жирмунского ДВО РАН –
УДК 582.26(58.036.5)
Интерес к криоконсервации микроводорослей актуален более 60 лет, однако разработать универсальный протокол для замораживания-оттаивания невозможно, и его подбирают эмпирически. Мы провели успешную криоконсервацию диатомовой водоросли Melosira sp. в присутствии 5% диметилсульфоксида и 2% поливинилпирролидона ступенчатым режимом замораживания. Диметилсульфоксид оказался более эффективным, позволяя сохранять большее количество клеток и их пролиферативный потенциал после оттаивания. Ключевые слова: диатомовые водоросли; Melosira sp.; криоконсервация; криопротекторы
Интерес к криоконсервации одноклеточных водорослей возник с 1960-х годов и данная тема остается актуальной до сих пор. Разработка универсального протокола для криоконсервации невозможна из-за недостаточного понимания всех механизмов повреждения клеток в процессах замораживания и оттаивания, а также из-за значительных морфологических и биохимических отличий между микроводорослями (Abreu et al., 2012). Морские виды микроводорослей, особенно образующие многоклеточные скопления, имеющие крупные клетки и вакуоли являются сложными для криосохранения. Цель настоящей работы заключалась в разработке способа криоконсервации водоросли Melosira sp. (Bacillariophyta) и оценке скорости её восстановления после криоконсервации. Материалы и методы. Культура диатомовой водоросли Melosira sp. была выделена Ж.В. Маркиной и А.В. Бородой из пробы морской воды, отобранной на выходе из р. Армань (Амахтонский залив, Охотское море) в июле 2023 г. Генетическое определение водоросли проведено К.В. Ефимовой. Клетки культивировали в среде f (Guillard, Ryther, 1962) при 18°C с периодическим встряхиванием, освещением люминесцентными лампами белого света с интенсивностью 70 мкмоль фотонов/(м2×с) (3500 люкс) и свето-темновым периодом 12 ч свет : 12 ч темнота до конца логарифмической фазы роста (9 сут), после чего проводили криоконсервацию. Концентрацию клеток определяли с помощью прямого визуального подсчета под световым инвертированным микроскопом Axiovert-200M (Carl Zeiss, Германия) с использованием камеры Нажотта. Клетки без видимого плазмолиза и с интактными оболочками и хлоропластами считали живыми. Микроводоросли замораживали до температуры жидкого азота (-196°C) в присутствии диметилсульфоксида (ДМСО), как классического проникающего внутрь клетки криопротектора, и поливинилпирролидона (ПВП) – непроникающего криопротектора. Растворы криопротекторов готовили на стерильной морской воде (МВ) с соленостью 32‰. ДМСО добавляли до конечной концентрации 5% (об/об), ПВП до 2% (масса/об). Суспензию микроводорослей переносили в 2 мл криопробирки и постепенно добавляли охлаждённые растворы криопротекторов. Криоконсервацию проводили ступенчато: криопробирки охлаждали до -10°C со скоростью 1°C/мин, затем до -45°C со скоростью 1,7°C/мин, далее до -90°C со скоростью 2,0°C/мин и переносили в жидкий азот. После хранения в жидком азоте образцы оттаивали на водяной бане при +30°C, переносили в 15 мл пробирки и постепенно разбавляли МВ в 10 раз. Клетки осаждали центрифугированием, промывали МВ, ресуспендировали в питательной среде и культивировали, как описано выше. Эксперименты проведены в трех биологических повторностях. Данные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение. Статистическую обработку данных осуществляли в программе Excel (Microsoft, США). Результаты. Рост контрольных клеток Melosira sp. описывается типичной
Рис. 1. Динамика численности клеток диатомовой водоросли Melosira sp. Fig. 1. Cell number dynamics of diatom alga Melosira sp. in control and after cryopreservation.
К третьим суткам после криоконсервации часть клеток погибала независимо от использованного криопротектора, причём большее количество клеток погибало в случае, если в качестве криопротектора использовали только ДМСО. Однако при этом с 10 сут после оттаивания восстановление культуры происходило быстрее. Даже спустя 21 сут после криоконсервации в суспензии оставались поврежденные клетки (рис. 2), но в культуре наблюдали постепенный рост нитей водорослей.
Рис. 2. Внешний вид Melosira sp. после криоконсервации и в контроле: а) – в день оттаивания после криоконсервации в ДМСО, б) – на 21-е сутки культивирования после криоконсервации в ДМСО, в) – в день оттаивания после криоконсервации в ПВП, г) – на 21-е сутки культивирования после криоконсервации с ПВП, д, е) – контроль. Fig. 2. The appearance of Melosira sp. after cryopreservation and in control.
ДМСО является проникающим внутрь клеток криопротектором, связывающим воду внутри клеток и блокирующим формирование внутриклеточного льда – основной причины гибели клеток. Однако, он является токсичным для многих клеток (Miyagi-Shiohira et al., 2015). В качестве эффективной малотоксичной альтернативы при криоконсервации водорослей иногда использовали ПВП (Benhra et al., 1997). Однако, ПВП практически бесполезен при замораживании относительно крупных клеток, какими являются клетки Melosira sp. (более 10–15 мкм), с высоким содержанием воды из-за его неспособности проникнуть через клеточную стенку (Hubalek, 2003) и, таким образом, предотвратить образование внутриклеточного льда. Успешность криоконсервации можно измерить количеством клеток, которые остаются жизнеспособными и возобновляют нормальную физиологическую активность после оттаивания. Рекомендуемая минимальная жизнеспособность после криоконсервации культур микроводорослей, хранящихся в Коллекции культур водорослей и простейших CCAP (Великобритания), составляет 60% (Morris, 1981). Однако для многих видов водорослей это значение невозможно достичь по разным причинам: их жизнеспособность после оттаивания не превышает 5% (Day, Brand, 2005). Выживаемость Melosira sp. сразу после оттаивания составляла 4,8% для варианта с ДМСО и 12,2% для варианта с ПВП, но восстановление культуры до 66% в опыте с ДМСО и 33% в опыте с ПВП от первоначального количества происходило за 3 недели, что достаточно быстро, учитывая относительно крупный размер клеток и наличие вакуоли, занимающей большую часть клетки.
Финансирование. Работа выполнена в рамках государственной темы ННЦМБ ДВО РАН «Динамика морских экосистем, адаптации организмов и сообществ к факторам внешней среды» (№ 124021900009-6). Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов, требующего раскрытия в данной статье.
Список литературы
Статья поступила в редакцию 18.06.2025
Об авторах Маркина Жанна Васильевна – Zhanna V. Markina кандидат биологических наук zhannav@mail.ru Борода Андрей Викторович – Andrei V. Boroda кандидат биологических наук borodandy@gmail.com
ССЫЛКА: Маркина Ж.В., Борода А.В. Криоконсервация диатомовой водоросли Melosira sp. // Вопросы современной альгологии. 2025. № 1–2(37–38). С. 384–388. URL: http://algology.ru/2229 DOI – https://doi.org/10.33624/2311-0147-2025-1(37)-384-388 EDN – IJKZJH
Уважаемые коллеги! Если Вы хотите получить версию статьи в формате PDF, пожалуйста, напишите в редакцию, и мы ее вам с удовольствием пришлем бесплатно.
Cryopreservation of Melosira sp. (Bacillariophta) Zhanna V. Markina, Andrei V. Boroda Zhirmunsky National Scientific Center of Marine Biology, Far Eastern Branch, RAS (Vladivostok, Russia)
Interest in cryopreservation of microalgae has been topical for over 60 years, but it is impossible to develop a universal protocol for freezing and thawing and it is selected empirically. We have successfully cryopreserved the diatom Melosira varians in the presence of 5% dimethyl sulfoxide and 2% polyvinylpyrrolidone using a stepwise freezing. Dimethyl sulfoxide turned out to be more effective, allowing us to preserve a larger number of cells and their proliferative potential after thawing. Key words: Diatom; Melosira sp.; cryopreservation; cryoprotectants
References
Authors Markina Zhanna V. ORCID – https://orcid.org/0000-0001-7135-1375 Zhirmunsky National Scientific Center of Marine Biology, Far Eastern Branch, RAS, Russia, Vladivostok zhannav@mail.ru Boroda Andrei V. ORCID – https://orcid.org/0000-0003-0257-748X; eLIBRARY SPIN-код – 1506-4382 Zhirmunsky National Scientific Center of Marine Biology, Far Eastern Branch, RAS, Russia, Vladivostok borodandy@gmail.com
ARTICLE LINK: Markina Zh.V., Boroda A.V. Cryopreservation of Melosira sp. (Bacillariophta). Voprosy sovremennoi algologii (Issues of modern algology). 2025. № 1–2(37–38). С. 384–388. URL: http://algology.ru/2229 DOI – https://doi.org/10.33624/2311-0147-2025-1(37)-384-388 EDN – IJKZJH
Dear colleagues! If you want to receive the version of the article in PDF format, write to the editor, please and we send it to you with pleasure for free.
На ГЛАВНУЮ
|
|
|
 | | ||
|
| ||
