Аверина С.Г.¹, Цветикова С.А.², Полякова Е.Ю.¹, Величко Н.В.¹, Пиневич А.В.¹

Svetlana G. Averina, Sofya A. Tsvetikova, Elena Y. Poliakova, Natalia V. Velichko, Alexander V. Pinevich

¹Cанкт-Петербургский Государственный Университет (Санкт-Петербург, Россия)
²Университет ИТМО (Санкт-Петербург, Россия)

УДК 582.232.2

Работа посвящена исследованию антарктических штаммов цианобактерий рода Pseudanabaena, в частности, их способности расти при низких температурах, а также анализу их филогенетического положения. Штаммы Pseudanabaena sp. CALU 1773, CALU 1785, CALU 1787 и CALU 1791 выращивали при различных температурах, рост оценивали путем определения оптической плотности суспензий и биомассы по сухому весу. Дополнительно проводили морфометрический анализ клеток. Полученные результаты позволяют рассматривать антарктические штаммы р. Pseudanabaena как психротолерантные организмы, имеющие температурный оптимум при ˂15°С и способные расти при температуре 20°С. При неоптимальных температурах роста (4°С и 22°С) наблюдается деформация клеток. Анализ последовательностей гена 16S рРНК показал, что представители р. Pseudanabaena в целом отличаются высоким уровнем генетической вариабельности. Исследуемые антарктические штаммы образуют общую ветвь, но дистанцированы от арктического психротолерантного штамма Pseudanabaena catenata USMAC16. Полученные данные свидетельствуют о том, что адаптация к росту при низких температурах могла возникать у представителей р. Pseudanabaena неоднократно.

Ключевые слова: цианобактерии; психротолерантность; молекулярная филогения

Способность осуществлять оксигенную фототрофию в сочетании с ассимиляцией неорганического углерода позволяет цианобактериям занимать самые разнообразные, порой очень суровые, местообитания. В составе низкотемпературных экологических ниш (полярные регионы и высокогорные участки) они часто являются основными первичными продуцентами (Straka, Stokes, 1960; Pandey et al., 2004; Zakhia et al., 2008). Несмотря на способность многих цианобактерий расти и размножаться при низких температурах, описано мало истинно психрофильных форм (Tang et al., 1997; Tang, Vincent, 1999; Nadeau, Castenholz, 2000; Hong et al., 2013; Khan et al., 2017), имеющих оптимум роста при температуре ниже 15°С и не растущих при температуре выше 20°С (Morita, 1975). Выделение и изучение цианобактерий из холодных мест обитания позволяет расширить наши теоретические знания об адаптациях в этой экстремальной нише, а также получить новые штаммы-продуценты, перспективные в отношении синтеза разнообразных биологически активных соединений.

Штаммы цианобактерий Pseudanabaena sp. CALU 1773, CALU 1785, CALU 1787 и CALU 1791 были выделены из биомассы биопленок и обрастаний оз. Степпед (Восточная Антарктида, оазис Холмы Ларсеманн) в 2015 г. из накопительных культур, выращенных при температуре 8–10°С на среде BG11, и поддерживались в тех же условиях. Штаммы отличались по составу вспомогательных пигментов фотосинтетического аппарата. На спектрах поглощения культур CALU 1785, CALU 1787 и CALU 1791 (спектрофотометр Unico 2802S UV/VIS) были выявлены две основные формы фикобилипротеинов: фикоэритрин и фикоцианин, причем содержание первого было достаточно высоким, и биомасса приобретала малиновую или коричневую окраску. Штамм CALU 1773 содержал лишь фикоцианин и имел сине-зеленую окраску. Для выявления температурного оптимума роста исследуемые штаммы культивировали в течение 28 суток в жидкой среде BG11 при температурах 4–6, 8–10, 12–13 и 22–24°С и постоянном освещении интенсивностью 500 лк. Рост оценивали, измеряя оптическую плотность культур при 680 нм (спектрофотометр Unico 2802S UV/VIS) и сухой вес биомассы. Кроме того, проводили морфометрию клеток на разных этапах культивирования (микроскоп Leica DM2500, снабженный камерой Leica DFC500).

Выделение тотальной ДНК из клеток осуществляли с использованием СТАВ-метода (Murray, Thompson, 1980). Амплификацию фрагмента гена 16S рРНК проводили праймерами 27f и 1492r (Lane, 1991) в режиме: предварительная денатурация при 95°С (5 мин); 30 циклов амплификации с денатурацией при 95°С (1 мин), отжигом праймеров при 54°С (30 с), элонгацией при 72°С (1,5 мин); заключительный синтез при 72°С (10 мин). Амплификацию участка ITS проводили с праймерами 322f и 340r (Iteman et al., 2000) в следующем режиме: предварительная денатурация при 94°С (5 мин); 30 циклов амплификации с денатурацией при 94°С (45 с), отжигом праймеров при 57°С (30 с), элонгацией при 72°С (1 мин); заключительный синтез при 72°С (10 мин). Для амплификации использовали набор ScreenMix-HS (Евроген, Россия). Объем пробы составлял 25 мкл и включал праймеры в концентрации 80 нМ и 10–20 нг ДНК-матрицы. ПЦР-фрагменты выделяли с использованием набора Nucleospin® Gel & PCR Clean-Up (Macherey Nagel) и секвенировали по Сэнгеру. Дендрограммы филогенетического сходства строили с использованием программы MEGA5 (Tamura et al., 2011) методом Neighbor-Joining (Saitou, Nei, 1987). Эволюционные расстояния рассчитывались с использованием метода K2+G (Nei, Kumar, 2000). Для анализа, помимо оригинальных последовательностей, использовали данные из GenBank.

Согласно полученным результатам, активный рост штаммов CALU 1785, CALU 1787 и CALU 1791 происходил при температурах 8–10 и 12–13°С, при этом выход биомассы был почти одинаковым. Штамм CALU 1773 наиболее интенсивно рос при температуре 12–13°С. В пользу того, что указанные температуры являются оптимальными для роста наших штаммов, свидетельствуют данные морфометрии клеток в процессе культивирования: средние длина и ширина клеток, а также значения стандартного отклонения оставались постоянными. Развитие культур при температурах 4–6 и 22–24°С приводило к искажению формы, изменению средних значений размеров клеток и увеличению значений стандартного отклонения.

Например, у штамма CALU 1773 при температуре 4–6°С происходило резкое увеличение длины клеток, причиной которого могут быть нарушения в процессе клеточного деления, а диаметр изменялся мало. При температуре 22–24°С у этого штамма резко увеличивался диаметр клеток, что приводило к «раздуванию» и деформации и может объясняться нарушением процессов синтеза компонентов оболочки. Для штаммов CALU 1785, CALU 1787 и CALU 1791 наиболее значительные искажения морфологии обнаруживались в условиях роста при 22–24°С. Из-за нарушения процесса деления клеток, в культурах образовывались нитевидные структуры, длина которых в 3–4 раза превышала длину клеток, зарегистрированную в оптимальных условиях роста. Клетки раздувались и приобретали нетипичную для представителей р. Pseudanabaena веретенообразную форму.

Таким образом, исследуемые штаммы антарктических цианобактерий рода Pseudanabaena (CALU 1773, 1785, 1787 и 1791) являются психротолерантными микроорганизмами с оптимумом роста в диапазоне температур 8–13°С и способностью развиваться при температурах выше 20°С. Согласно анализу данных литературы, арктический штамм Pseudanabaena catenata USMAC16, выделенный из бентосного сообщества Шпицбергена, также является психротолерантным, поскольку растет с максимальной скоростью при температуре 15°С и способен расти при 25°С (Khan et al., 2017).

Для оценки генетического сходства исследуемых антарктических штаммов цианобактерий рода Pseudanabaena были проанализированы последовательности генов 16S рРНК и участков внутренних транскрибируемых спейсеров рибосомного оперона (16–23S ITS). Полученные почти полноразмерные последовательности генов 16S рРНК штаммов (~1350 п.н.) сравнивали с последовательностями из базы данных с использованием инструмента BLAST (The Basic Local Alignment Search Tool). Результаты сравнения свидетельствуют о высоком уровне генетического разнообразия внутри рода Pseudanabaena. Например, штамм CALU 1773, имел степень сходства с другими представителями рода в пределах 89–98%, в то время как степень сходства с одноклеточной цианобактерией Synechococcus sp. PCC7009 составляет 86%. Полученные результаты также подтверждают филогенетическую близость цианобактерий рода Pseudanabaena с представителями р. Limnothrix. Для штаммов с малиновой окраской клеток CALU 1785, 1787, 1791 уровень сходства последовательности гена 16S рРНК с соответствующими последовательностями Limnothrix sp. составляет 98%.

Согласно полученным данным, последовательности антарктических штаммов цианобактерий р. Pseudanabaena, имеющих малиновую окраску клеток (штаммы CALU 1785, 1787, 1791), образуют отдельную ветвь. Штамм CALU 1773 с сине-зеленой окраской занимает соседнее с вышеуказанной ветвью положение. Все наши последовательности локализованы обособленно от референсных форм рода Pseudanabaena – штаммов коллекции РСС (Castenholz et al., 2001). Арктический психротолерантный штамм Pseudanabaena catenata USMAC16 расположен на дендрограмме дистантно от исследуемых штаммов и группируется со штаммом Pseudanabaena sp. PCC 7408.

Последовательности внутренних транскрибируемых спейсеров рибосомного оперона в последнее время активно используются с целью сравнения и разделения цианобактерий на внутриродовом уровне. Анализ ITS исследуемых штаммов выявил присутствие в их составе последовательностей двух тРНК (для аминокислот изолейцина и аланина). Обнаружены особенности вторичной структуры отдельных маркерных участков, таких как D1-D1′-домен и B-box, в сравнении с таковыми у мезофильных штаммов рода Pseudanabaena и психротолерантного арктического штамма Pseudanabaena catenata USMAC16.

Таким образом, исследуемые штаммы являются психротолерантными формами цианобактерий, способными активно расти и размножаться при температурах 8–13°С. Возможно, они образуют обособленную филогенетическую группу в составе р. Pseudanabaena. Вероятно, адаптация к росту в условиях низких температур возникала у представителей р. Pseudanabaena неоднократно, о чем свидетельствуют данные о дистантном филогенетическом положении арктического психротолерантного штамма Pseudanabaena catenata USMAC16. Механизмы возникновения подобных адаптаций до сих пор еще полностью не исследованы и требуют дальнейшего изучения.

Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ 20-04-00020а.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов, требующего раскрытия в данной статье.

Список литературы

1. Castenholz R.W., Rippka R., Herdman M., Wilmotte A. Form-genus XII. Pseudanabaena (Lauterborn 1916) // Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology. – Heidelberg: Springer Verlag, 2001. – P. 554–557.
2. Hong J.W., Kim S.H., Choi H.-G., Kang S.-H., Yoon H.-S. Isolation and description of a globally distributed cryosphere cyanobacterium from Antarctica // Polar Research. 2013. V.32. Р. 18529. DOI: https://doi.org/10.3402/polar.v32i0.18529
3. Iteman I., Rippka R., Tandeau de Marsac N., Herdman M. Comparison of conserved structural and regulatory domains within divergent 16S rRNA spacer sequences of cyanobacteria // Microbiology. 2000. V.146. P. 1275–1286. DOI: https://doi.org/10.1099/00221287-146-6-1275
4. Khan Z., Wan Omar W.M., Merican F.M.M.S., Azizan A.A., Foong C.P., Convey P., Najimudin N., Smykla J., Alias S.A. Identification and phenotypic plasticity of Pseudanabaena catenata from the Svalbard archipelago. Polish Polar Research. 2017. V.38. P. 445–458. DOI: https://doi.org/10.1515/popore-2017-0022
5. Lane J.D. 16S/23S rRNA sequencing // Stackebrandt E. and Goodfellow M. (ed.). Nucleic Acid Techniques in Bacterial Systematic. – New York: John Wiley and Sons, 1991. –P. 115–175.
6. Morita R.Y. Psychrophilic bacteria // Bacteriological Reviews. 1975. V.39. P. 144–167.
7. Murray M.G., Thompson W.F. Rapid isolation of high molecular weight plant DNA // Nucleic Acids Res. 1980. V.8. P. 4321–4325. DOI: https://doi.org/10.1093/nar/8.19.4321
8. Nadeau T.L., Castenholz R.W. Characterization of psychrophilic oscillatorians (Cyanobacteria) from Antarctic meltwater ponds // Journal of Phycology. 2000. V.36. P. 914–923. DOI: https://doi.org/10.1046/j.1529-8817.2000.99201.x
9. Nei M., Kumar S. Molecular Evolution and Phylogenetics // New York: Oxford University Press, 2000. – 333 p.
10. Pandey K.D., Shukla S.P., Shukla P.N., Giri D.D., Singh J.S., Singh P., Kashyapp A.K. Cyanobacteria in Antarctica: ecology, physiology and cold adaptation. Cellular and Molecular Biology (Noisy-le-Grand, France). 2004. V.50. P. 575–584.
11. Saitou N., Nei M. The neighbor-joining method: A new method for reconstructing phylogenetic trees // Molecular Biology and Evolution. 1987. V.4. P. 406–425.
12. Straka R.P., Stokes J.L. Psychrophilic bacteria from Antarctica // Journal of Bacteriology. 1960. V.80. P. 622–625.
13. Tamura K., Peterson D., Peterson N., Stecher G., Nei M., Kumar S. MEGA5: Molecular Evolutionary Genetics Analysis using Maximum Likelihood, Evolutionary Distance, and Maximum Parsimony Methods // Molecular Biology and Evolution. 2011. V.28. P. 2731–2739. DOI: https://doi.org/10.1093/molbev/msr121
14. Tang E.P.Y., Tremblay R., Vincent W.F. Cyanobacterial dominance of polar freshwater ecosystems: are high-latitude mat-formers adapted to low temperature? // Journal of Phycology. 1997. V.33. P. 171–181. DOI: https://doi.org/10.1111/j.0022-3646.1997.00171.x
15. Tang E.P.Y., Vincent W.F. Strategies of thermal adaptation by high-latitude cyanobacteria // New Phytologist. 1999. V.142. P. 315–323. DOI: https://doi.org/10.1046/j.1469-8137.1999.00385.x
16. Zakhia F., Jungblut A., Taton A., Vincent W., Wilmotte A. Cyanobacteria in Cold Ecosystems // In: Margesin R., Schinner F., Marx J.-C., Gerday C. (ed.) Psychrophiles: from Biodiversity to Biotechnology. – Berlin, Heidelberg: Springer, 2008. – P. 121–132. DOI: https://doi.org/10.1007/978-3-540-74335-4_8
    

Статья поступила в редакцию 30.06.2020
После доработки 22.11.2020
Статья принята к публикации 24.11.2020

Об авторах

Аверина Светлана Геннадиевна – Svetlana G. Averina

кандидат биологических наук
доцент, Санкт-Петербургский Государственный Университет, Санкт-Петербург, Россия (Saint Petersburg State University, St Petersburg, Russia), кафедра микробиологии

s.averina@spbu.ru

Цветикова Софья Андреевна – Sofya A. Tsvetikova

студент, Санкт-Петербургский национальный исследовательский Университет информационных технологий, механики и оптики (ITMO National Research University, Saint Petersburg, Russia), лаборатория микробиологии

zvetikova@scamt-itmo.ru

Полякова Елена Юрьевна – Elena Y. Poliakova

студент, Санкт-Петербургский Государственный Университет, Санкт-Петербург, Россия (Saint Petersburg State University, St Petersburg, Russia), кафедра микробиологии

helen159951@gmail.com

Величко Наталия Владиславовна – Natalia V. Velichko

кандидат биологических наук
научный сотрудник, Санкт-Петербургский Государственный Университет, Санкт-Петербург, Россия (Saint Petersburg State University, St Petersburg, Russia), кафедра микробиологии

n.v.velichko@mail.ru

Пиневич Александр Васильевич – Alexander V. Pinevich

доктор биологических наук
профессор, Санкт-Петербургский Государственный Университет, Санкт-Петербург, Россия (Saint Petersburg State University, St Petersburg, Russia), Ресурсный центр «Культивирование микроорганизмов» Научного парка СПбГУ

a.pinevich@spbu.ru

Корреспондентский адрес: 199178, Россия, г. Санкт-Петербург, 16-я линия В.О., д. 29, каф. микробиологии СПбГУ. Телефон (812) 321-33-59.

ССЫЛКА:

Аверина С.Г., Цветикова С.А., Полякова Е.Ю., Величко Н.В., Пиневич А.В. Антарктические цианобактерии рода Pseudanabaena – пример психротолерантных микроорганизмов // Вопросы современной альгологии. 2020. № 2 (23). С. 57–62. URL: http://algology.ru/1659

DOI – https://doi.org/10.33624/2311-0147-2020-2(23)-57-62

При перепечатке ссылка на сайт обязательна

Уважаемые коллеги! Если Вы хотите получить версию статьи в формате PDF, пожалуйста, напишите в редакцию, и мы ее вам с удовольствием пришлем бесплатно. 
Адрес - info@algology.ru

Antarctic cyanobacteria of the genus Pseudanabaena – an example
of psychrotolerant microorganisms

Svetlana G. Averina¹, Sofya A. Tsvetikova², Elena Y. Poliakova¹, Natalia V. Velichko¹, Alexander V. Pinevich¹

¹Saint Petersburg State University (St Petersburg, Russia)
²ITMO National Research University (Saint-Petersburg, Russia)

This research focuses on the Pseudanabaena genus Antarctic strains, in particular on their ability to grow at low temperature, as well as on their phylogenetic relatedness with other cyanobacteria. Pseudanabaena sp. strains CALU 1773, CALU 1785, CALU 1787 and CALU 1791 were cultured at various temperatures. Culture growth was monitored via cell suspension optical density, and biomass was measured by cell dry weight; additionally, a morphometric analysis was performed. Based on the obtained data, it was concluded that Antarctic Pseudanabaena strains represent psychrotolerant objects (they are able to grow at 20°С although their growth optimum is ˂15°С). At suboptimal temperatures (4°С and 22°С), cells get deformed. Analysis of 16S rRNA sequences of studied strains together with those from GenBank demonstrated a high genetic variability within the genus Pseudanabaena. The studied Antarctic strains formed branch which is distinct from the Arctic psychotolerant strain of Pseudanabaena catenata USMAC16. The obtained data indicate that adaptation to low temperatures could occur in representatives of the genus Pseudanabaena more than once.

Key words: cyanobacteria; psychrotolerance; molecular phylogeny.

References

1. Castenholz R.W., Rippka R., Herdman M., Wilmotte A. Form-genus XII. Pseudanabaena (Lauterborn 1916). In: Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology. Springer Verlag, Heidelberg, 2001. P. 554–557.
2. Hong J.W., Kim S.H., Choi H.-G., Kang S.-H., Yoon H.-S. Isolation and description of a globally distributed cryosphere cyanobacterium from Antarctica. Polar Research. 2013. V.32. Р. 18529. DOI: https://doi.org/10.3402/polar.v32i0.18529
3. Iteman I., Rippka R., Tandeau de Marsac N., Herdman M. Comparison of conserved structural and regulatory domains within divergent 16S rRNA spacer sequences of cyanobacteria. Microbiology. 2000. V.146. P. 1275–1286. DOI: https://doi.org/10.1099/00221287-146-6-1275
4. Khan Z., Wan Omar W.M., Merican F.M.M.S., Azizan A.A., Foong C.P., Convey P., Najimudin N., Smykla J. and Alias S.A. Identification and phenotypic plasticity of Pseudanabaena catenata from the Svalbard archipelago. Polish Polar Research. 2017. V.38. P. 445–458. DOI: https://doi.org/10.1515/popore-2017-0022
5. Lane J.D. 16S/23S rRNA sequencing. In: Stackebrandt E. and Goodfellow M. (ed.). Nucleic Acid Techniques in Bacterial Systematic. John Wiley and Sons, New York, 1991. P. 115–175.
6. Morita R.Y. Psychrophilic bacteria. Bacteriological Reviews. 1975. V.39. P. 144–167.
7. Murray M.G., Thompson W.F. Rapid isolation of high molecular weight plant DNA. Nucleic Acids Res. 1980. V.8. P. 4321–4325. DOI: https://doi.org/10.1093/nar/8.19.4321
8. Nadeau T.L., Castenholz R.W. Characterization of psychrophilic oscillatorians (Cyanobacteria) from Antarctic meltwater ponds. Journal of Phycology. 2000. V.36. P. 914–923. DOI: https://doi.org/10.1046/j.1529-8817.2000.99201.x
9. Nei M., Kumar S. Molecular Evolution and Phylogenetics. Oxford University Press, New York, 2000. 333 p.
10. Pandey K.D., Shukla S.P., Shukla P.N., Giri D.D., Singh J.S., Singh P., Kashyapp A.K. Cyanobacteria in Antarctica: ecology, physiology and cold adaptation. Cellular and Molecular Biology (Noisy-le-Grand, France). 2004. V.50. P. 575–584.
11. Saitou N., Nei M. The neighbor-joining method: A new method for reconstructing phylogenetic trees. Molecular Biology and Evolution. 1987. V.4. P. 406–425.
12. Straka R.P., Stokes J.L. Psychrophilic bacteria from Antarctica. Journal of Bacteriology. 1960. V.80. P. 622–625.
13. Tamura K., Peterson D., Peterson N., Stecher G., Nei M., Kumar S. MEGA5: Molecular Evolutionary Genetics Analysis using Maximum Likelihood, Evolutionary Distance, and Maximum Parsimony Methods. Molecular Biology and Evolution. 2011. V.28. P. 2731–2739. DOI: https://doi.org/10.1093/molbev/msr121
14. Tang E.P.Y., Tremblay R., Vincent W.F. Cyanobacterial dominance of polar freshwater ecosystems: are high-latitude mat-formers adapted to low temperature? Journal of Phycology. 1997. V.33. P. 171–181. DOI: https://doi.org/10.1111/j.0022-3646.1997.00171.x
15. Tang E.P.Y., Vincent W.F. Strategies of thermal adaptation by high-latitude cyanobacteria. New Phytologist. 1999. V.142. P. 315–323. DOI: https://doi.org/10.1046/j.1469-8137.1999.00385.x
16. Zakhia F., Jungblut A., Taton A., Vincent W., Wilmotte A. Cyanobacteria in Cold Ecosystems. In: Margesin R., Schinner F., Marx J.-C., Gerday C. (ed.) Psychrophiles: from Biodiversity to Biotechnology. Springer, Berlin, Heidelberg, 2008. P. 121–132. DOI: https://doi.org/10.1007/978-3-540-74335-4_8
    

Authors

Averina Svetlana G.

Orcid ID – https://orcid.org/0000-0003-0890-1834

Saint Petersburg State University, St. Petersburg, Russia

s.averina@spbu.ru

Tsvetikova Sofya A.

Orcid ID – https://orcid.org/0000-0003-0580-9522

ITMO National Research University, St. Petersburg, Russia

zvetikova@scamt-itmo.ru

Poliakova Elena Y.

Orcid ID – https://orcid.org/0000-0003-4117-7884

Saint Petersburg State University, St. Petersburg, Russia

helen159951@gmail.com

Velichko Natalia V.

Orcid ID – https://orcid.org/0000-0002-0540-9425

Saint Petersburg State University, St. Petersburg, Russia

n.v.velichko@mail.ru

Pinevich Alexander V.

Orcid ID – https://orcid.org/0000-0002-3949-156X

Saint Petersburg State University, St. Petersburg, Russia

a.pinevich@spbu.ru

ARTICLE LINK:

Averina S.G., Tsvetikova S.A., Poliakova E.Y., Velichko N.V., Pinevich A.V. Antarctic cyanobacteria of the genus Pseudanabaena – an example of psychrotolerant microorganisms. Voprosy sovremennoi algologii (Issues of modern algology). 2020. № 2 (23). С. 57–62. URL: http://algology.ru/1659

DOI – https://doi.org/10.33624/2311-0147-2020-2(23)-57-62

When reprinting a link to the site is required

Dear colleagues! If you want to receive the version of the article in PDF format, write to the editor,please and we send it to you with pleasure for free. 
Address - info@algology.ru

На ГЛАВНУЮ

Карта сайта

КОНТАКТЫ

Email: info@algology.ru

Изготовление интернет сайта
5Dmedia

ЛИЦЕНЗИЯ

Эл N ФС 77-22222 от 01 ноября 2005г.

ISSN 2311-0147