Парамонов Л.Е.

Leonid E. Paramonov

Институт океанологии имени П.П. Ширшова РАН, Южное отделение (Геленджик, Россия)

УДК 535.34.574.583

Рассматривается способ восстановления коэффициентов поглощения пигментов Spirulina platensis с использованием спектров поглощения нативных клеток и исключающий использование экстрактов. Обсуждаются оценки внутриклеточной концентрации хлорофилла а, С-фикоэритрина, С-фикоцианина и аллофикоцианина в нативных клетках.

Ключевые слова: спектр коэффициентов поглощения; Spirulina platensis; хлорофилл а; С-фикоцианин; аллофикоцианин; С-фикоэритрин.

Введение

Поглощение света фитопланктоном – один из основных факторов изменения оптических свойств океанических и прибрежных вод, содержит информацию о пигментах в клетках и является основой различных приложений (Kirk, 2011; Morel, 1991; Platt, Sathyendranath, 1988; Sathyendranath et al, 2001; Шифрин, 1983). Содержание хлорофилла а в фитопланктоне служит важной характеристикой оценки первичной биопродуктивности (Кобленц-Мишке, Ведерников, 1977; Минеева, 2011; Мордасова, 2014). Данные по содержанию хлорофилла а позволяют охарактеризовать продуктивность вод Мирового океана, морей и водоемов, в том числе и с использованием дистанционных методов (Platt, Sathyendranath, 1988). При определении концентрации пигментов в фитопланктоне используются рекомендации Научного комитета по океаническим исследованиям ЮНЕСКО (SCOR-UNESCO Working Group Number 17, 1966), и межгосударственный стандарт (ГОСТ 17.1.4.02-90, 1999) для определения хлорофилла а. Методы высокоэффективной жидкостной хроматографии, спектрофотометрический и флуориметрический дают достоверные результаты при оценке концентрации в случае исследования раствора одного хлорофилла а (Daemen, 1986), отмечается, что при исследовании экстрактов смеси пигментов предпочтительнее использовать спектрофотометрический метод и метод хроматографии.

Отмеченные результаты являются эталонными и используются для оценки достоверности и корректности определения концентрации пигментов в лабораторном и натурном экспериментах на основе безэкстрактных спектрофотометрических и флуориметрических методов. Эти  методы (включая лазерно-индуцированную флуоресценцию) определения содержания пигментов без нарушения целостности клеток наиболее перспективны в натурных экспериментах, океанологических исследованиях фитопланктона и лабораторных экспериментах с монокультурами водорослей. Однако имеются существенные ограничения – между измеренными спектрами оптической плотности, как и спектрами флуоресценции, и концентрацией пигментов существуют достаточно сложные зависимости.

В настоящей статье на основе результатов и экспериментальных спектров поглощения нативных клеток (Парамонов, 2018) в видимой области спектра восстанавливаются коэффициенты поглощения раствора пигментов цианобактерии Spirulina platensis. Полученные данные позволяют оценить вариации коэффициентов поглощения взвесей нативных клеток, обусловленные эффектом упаковки (Duysens. 1956), с учетом распределения по размерам и форме Spirulina platensis. Внутриклеточная концентрация хлорофилла а, С-фикоцианина, аллофикоцианина и С-фикоэритрина оценивается с использованием а) разложения спектра коэффициентов поглощения пигментов на гауссианы (Hoepffner,  Sathyendranath, 1991) и б) данных об удельных коэффициентах поглощения отмеченных пигментов (Boussiba, Richmond, 1979; Ficek et al, 2004; Simis, Kauko, 2012). Трихомы Spirulina platensis состоят из множества гомоцитных клеток, что обеспечивает равномерное распределение пигментов внутри цианобактерии. Это обстоятельство и определяет выбор объекта исследования.

Теоретические основания

Рассмотрим слой, например, раствора пигментов, на который перпендикулярно поверхности падает свет интенсивности I₀. В соответствии с законом Бугера-Ламберта-Бэра,  интенсивность излучения после прохождения оптического пути (длина кюветы) l имеет вид – I=I₀e^-cl,  – коэффициент ослабления, характеризующий раствор пигментов. При измерении ослабления света спектрофотометрами используется оптическая плотность D:

Известно, что c=b+a, здесь b и a коэффициенты рассеяния и поглощения соответственно. Оценка коэффициента поглощения раствора пигментов может быть проведена с использованием спектрофотометра, измеряющего коэффициент ослабления, так как в этом случае вклад рассеяния мал (b « a) и c ≅ a.

Для оценки коэффициента поглощения взвеси нативных клеток фитопланктона используют измерения спектрофотометров с интегрирующей сферой, чтобы исключить влияние рассеяния света, так как коэффициент рассеяния взвеси клеток сравним или может превышать коэффициент поглощения.

Для оценки сечений поглощения биологических клеток используем приближение аномальной дифракции (ван де Хюлст, 1961; Шифрин, 1983; Парамонов, 2018):

(1)

G рассматривается как площадь проекции частицы на плоскость xOy, ортогональную направлению падающего излучения, так и область интегрирования, α(λ)[м^-1] – коэффициент поглощения клеточного вещества, l(x,y) – длина оптического пути луча, через клетку и точку (x,y),  – мощность поглощенной клеткой энергии излучения, прошедшего через площадку dG. Второе равенство (1) является оценкой интеграла на основании теоремы о среднем, здесь <l> – средняя длина оптического пути лучей прошедших через клетку. С физической точки зрения сечение поглощения (1) – мощность поглощенной энергии, нормированной на интенсивность падающего на частицу излучения, и имеет размерность м².

Для усредненного сечения поглощения взвеси слабопреломляющих частиц используем формулу (Шифрин, Тонна 1992; Парамонов, 2018):

(2)

< V >, < G > – средние объем и площадь проекции клеток.

Формула (2) применима и к неоднородным клеткам, в этом случае <l> – средняя длина оптического пути через поглощающиеся структуры (хлоропласты, фикибилисомы), < G > – их площадь проекции.

В исследованиях полезно использовать коэффициент

(3)

характеризующий поглощение единицей объема клетки и эффект упаковки (Duysens. 1956), с ростом < l > эффективность поглощения уменьшается, максимальное значение достигается при молекулярном растворе пигментов (< l >=0): .

Spirulina platensis является нитевидной цианобактерией с цилиндрическими многоклеточными трихомами в левозакрученной спирали. В нашем исследовании в качестве модели Spirulina platensis выбрана вытянутая цилиндрическая частица, характеризующаяся длиной L и радиусом основания R. Для цилиндрических частиц с равномерным распределением по ориентациям в пространстве
Если R « L , то длина оптического пути <l>≈ 2·R и в этом случае поглощение единицей объема клетки не зависит от длины L. Следует различать оптический путь луча, прошедшего, например, через кювету и параметр <l> – средний оптический путь лучей, прошедших через клетки.

Результаты и обсуждение

При измерениях поглощения света клетками фитопланктона используются спектрофотометры с интегрирующими сферами, что позволяет исключить влияние рассеяния света. Однако существует проблема – неопределенной остается длина оптического пути лучей многократно прошедших через исследуемый образец. Калибровка представляет собой предмет отдельного исследования. В настоящее время для измерения поглощения широко используется техника, где взвесь клеток концентрируется на оптоволоконных фильтрах, необходима коррекция, связанная с рассеянием света, к тому же клетки фитопланктона располагаются большей площадью проекции к направлению света, что уменьшает величину <l>, увеличивая эффективность поглощения единицей объема.

В настоящем исследовании, чтобы исключить погрешности применения абсолютных измерений, используем относительные величины. Полагаем, что в природных условиях и при измерениях трихомы Spirulina platensis хаотически (равномерно) ориентированы в пространстве.

При восстановлении спектра коэффициентов поглощения α(λ) пигментов Spirulina platensis использовали экспериментальные данные (Парамонов, 2018). На рис. 1 приведены спектры поглощения нативных клеток Spirulina platensis и этих же клеток, подвергнутых ультразвуковому воздействию; измерения проведены с помощью спектрофотометра СФ-14 с интегрирующей сферой.

Рис. 1. Спектры поглощения взвеси нативных клеток Spirulina platensis до (1) и после ультразвукового воздействия (2). Значения приводятся в относительных единицах оптической плотности

Fig. 1. Absorption spectra of suspensions of native Spirulina platensis cells before (1) and after ultrasound exposure (2). Values are given in relative units of optical density

При оценке спектра коэффициентов поглощения α(λ) пигментов Spirulina platensis использовали экспериментальные данные, приведенные на рис. 1, и данные микроскопического анализа: <l> = 5,73; 1,61 мкм соответственно для нативных и после ультразвукового воздействия клеток, оценка <l> точечная, объем каждой выборки превышал 100.

Теоретический анализ спектров коэффициентов поглощения включает следующие этапы.

А) Полагаем, что хлорофилл а не теряет поглощательной способности после ультразвукового воздействия. При λ = 410 нм поглощение, при отсутствии растворенного органического вещества (РОВ), определяется исключительно хлорофиллом а. Из измеренного отношения коэффициентов поглощения нативных клеток до и после ультразвукового воздействия коэффициент поглощения пигментов a(410) находится как решение уравнения на основе формулы (2).

Б) При известном значении a(410) с использованием (2) и спектра коэффициентов поглощения взвеси нативных клеток (рис. 1, кривая 1) восстанавливается спектр коэффициентов поглощения раствора пигментов.

В) Одним из приложений полученных результатов является определение внутриклеточной концентрации пигментов. Для этого используем разложение спектра коэффициентов поглощения α(λ) раствора пигментов (рис. 2) на гауссианы

C_i (мг∙м^-3) – внутриклеточная концентрация пигментов, α^*_i(λ_i) (м^2∙мг^-1) – удельный коэффициент поглощения пигментов в локальных максимумах поглощения λ_i (нм) хлорофилла а (λ_i=384, 415, 436, 623, 675, 700), каротиноидов (λ_i=464, 493, 532), фикоэритрина (λ_i=565), фикоцианина (λ_i=611), аллофикоцианина (λ_i=658), σ_i характеризует полуширину распределения.

Рис. 2. Разложение спектра коэффициентов поглощения раствора пигментов α(λ) (мкм^-1) Spirulina platensis (1) в виде линейной комбинации гауссианов (2)

Fig. 2. Expansion of the spectrum of absorption coefficients of the pigment solution α(λ) (μm^-1) Spirulina platensis (1) in the form of a linear combination of Gaussians (2)

Данные (Ficek et al, 2004; Hoepffner, Sathyendranath, 1991): α^*i (675)=0,02 и (Boussiba, Richmond, 1979; Simis, Kauko, 2012): α^*i (611)=0,0073, α^*_i (565)=0,01, α^*i (656)=0,0058, а также результаты разложения (рис. 2) позволяют определить внутриклеточную концентрацию хлорофилла а – 5,15·10⁶ мг м^-3, фикоцианина – 14·10⁶ мг м^-3, фикоэритрина – 3,1·10⁶ мг м^-3, аллофикоцианина – 6,9·10⁶ мг м^-3.

В табл. 1 представлены коэффициенты поглощения раствора пигментов, нормированные на внутриклеточную концентрацию хлорофилла а (С_хл).

Таблица 1. Спектр коэффициентов поглощения α^*(λ) [м²мг^-1] раствора пигментов Spirulina platensis, нормированных на внутриклеточную концентрацию хлорофилла а

Table 1. Spectrum of absorption coefficients α^*(λ) [m²mg^-1] of Spirulina platensis pigment solution normalized to intracellular chlorophyll a concentration

На рис. 3 представлены спектры нормированных сечений поглощения  (мкм^-1) в зависимости от параметра <l>, иллюстрирующие эффект упаковки (Duysens. 1956). С увеличением <l> эффективность поглощения на единицу объема клетки для одинакового объема взвесей клеток и при неизменной внутриклеточной концентрации пигментов монотонно уменьшается. Сечение поглощения характеризует поглощательную способность фитопланктона, и для оценки мощности поглощенной энергии величину сечения поглощения необходимо умножить на величину облученности (интенсивности) падающего света. Поглощенная фитопланктоном энергия зависит от продолжительности светового дня или длительности освещения в условиях лабораторного эксперимента.

Чтобы избежать фотоингибирующего действия света, в летнее время в естественных водоемах при высоком уровне облученности Spirulina platensis сворачивается в клубок, уменьшая эффективность поглощения на единицу объема. В северо-восточной части Черного моря в весенне-зимний период доминируют мелкоклеточные диатомеи, а в летний период с увеличением облученности преобладают крупноклеточные диатомовые водоросли.

Рис. 3. Спектр нормированных сечений поглощения  (мкм^-1) в зависимости от параметра < l >=0(1)10(10)50 (мкм). Значения в скобках – величина шага между значениями 0, 10 и 10, 50 соответственно

Fig. 3. Spectrum of normalized absorption cross sections  (μm^-1) depending on the parameter < l >=0(1)10(10)50 (μm). Values in parentheses are the value of the step between the values 0, 10 and 10, 50, respectively

Основываясь на данных настоящего исследования, рассмотрим способ определения содержания хлорофилла а. Отношение коэффициентов поглощения взвесей нативных клеток Spirulina platensis, при использовании данных табл. 1 и формулы (2), имеет вид

(4)

По измеренным коэффициентам a(410), a(675) и найденной в результате микроскопического анализа оценке <l> [мкм], внутриклеточная концентрация [мг∙мл^-1] хлорофилла а (C_хл) находится как решение уравнения (4). Выбор длин волн λ для отношения коэффициентов поглощения обусловлен следующими соображениями:

а)  при λ=410 нм поглощение определяется только хлорофиллом а;
б) при λ=675 нм вклад в коэффициент поглощения, наряду с хлорофиллом а, вносят С-фикоцианин и аллофикоцианин (в нашем исследовании – 20%).

Аналогичный подход может быть использован и для диатомовых водорослей (Парамонов, 2017). Диатомеи, в отличие от Spirulina platensis, имеют подвижную систему хлоропластов и способны регулировать величину поглощенной энергии – равномерное распределение одиночных хлоропластов по объему клетки наблюдается при низких уровнях облученности, с увеличением облученности наблюдаются скопления хлоропластов.

Автор заявляет об отсутствии конфликта интересов, требующего раскрытия в данной статье.

Работа выполнена в соответствии с темой госзадания № 0149-2019-0014 ИО РАН.

Список литературы

1. Ван де Хюлст Г. Рассеяние света малыми частицами. – М.: Изд-во иностр. лит-ры. 1961. – 536 с.
2. ГОСТ 17.1.4.02-90. Вода. Методика спектрометрического определения хлорофилла а. – М.: Изд-во стандартов, 1999.
3. Кобленц-Мишке О.И., Ведерников В.И. Продукция морских сообществ // Первичная продукция. Биология океана. Т.2. Биологическая продуктивность океана. – М.: Наука, 1977. – С.183–209.
4. Минеева Н.М. Растительные пигменты как показатели биомассы фитопланктона // Альгология. 2011. Т.21. С.385–395.
5. Мордасова Н.В. Косвенная оценка продуктивности вод по содержанию хлорофилла // Труды ВНИРО. 2014. Т.152. С.41–56.
6. Парамонов Л.Е. Оценка спектров поглощения диатомовых водорослей на примере Chaetoceros protuberans // Вопросы современной альгологии. 2017. №1(13). URL:http://algology.ru/1094 (дата обращения – 25.10.2019)
7. Парамонов Л.Е. Спектр показателей поглощения и внутриклеточная концентрация пигментов цианобактерий на примере Spirulina platensis // Оптика атмосферы и океана. 2018. T.31. C. 103–108.
8. Шифрин К.С. Введение в оптику океана. – Л.: Гидрометеоиздат, 1983. – 278 c.
9. Шифрин К.С., Тонна Г. Простая формула для коэффициента поглощения слабопреломляющих частиц // Оптика и спектроскопия. 1992. Т.72. С. 487–490.
10. Boussiba S., Richmond E. Isolation and characterization of phycocyanins from the blue-green alga Spirulina platensis // Arch. Microbiol. 1979. V.120. P. 155–159.
11. Daemen E.A.M.J. Comparison of methods for the determination of chlorophyll in estuarine sediments // Netherlands Journal of Sea Research. 1986. V.20. P. 21–28.
12. Duysens L.M.N. The flattening effect of the absorption spectra of suspensions as compared to that of solutions // Biochim. Biophys. Acta. 1956. V.19. P. 1–12.
13. Ficek D., Kaczmarek S., Ston-Egiert J., Wozniak B., Majchrowski R., Dera J. Spectra of light absorption by phytoplankton pigments in the Baltic: conclusions to be drawn from a Gaussian analysis of empirical data // Oceanologia. 2004. V.46. P. 533–555.
14. Hoepffner N., Sathyendranath S. Effect of pigment composition on absorption properties of phytoplankton // Mar. Ecol. Prog. Ser. 1991. V.73. P. 11–23.
15. Kirk J.T.O. Light and Photosynthesis in Aquatic Ecosystems. Third edition. – Cambridge, University Press, 2011. – 509 p.
16. Morel A. Light and marine photosynthesis: a spectral model with geochemical and climatological implications // Prog. Oceanogr. 1991. V.26. P.263–306.
17. Platt T., Sathyendranath S. Oceanic primary production: estimation by remote sensing at local and regional scales // Science. 1988. V.241. P.1613–1620.
18. Sathyendranath S., Cota G., Stuart V., Maass H., Platt T. Remote sensing of phytoplankton pigments: a comparison of empirical and theoretical approaches // Int. J. Rem. Sens. 2001.V.22. P. 249–273.
19. SCOR-UNESCO Working Group Number 17. Determination of photosynthetic pigments // UNESCO Monographs in Oceanographic Methodology. 1966. №1. P. 9–18.
20. Simis S.G.H., Kauko H.M. In vivo mass-specific absorption spectra of phycobilipigments through selective bleaching // Limnol. Oceanogr.: Methods. 2012. V.10. P.214–226.

Статья поступила в редакцию 11.11.2019 
Статья поступила после доработки 19.01.2020
Статья принята к публикации 15.05.2020

Об авторе

Парамонов Леонид Евгеньевич − Paramonov Leonid E.

доктор физико-математических наук
ведущий научный сотрудник, Институт океанологии им.П.П.Ширшова РАН, Южное отделение, Геленджик, Россия (Shirshov Institute of Oceanology RAS, Southern Branch, Russia, Gelendzhik)

lparamonov@yandex.ru

Корреспондентский адрес: Россия, 353470, Краснодарский край, г. Геленджик, ул. Просторная 1-г. Телефон/факс 8-861-41-280-89.

ССЫЛКА НА СТАТЬЮ:

Парамонов Л.Е. Оценка содержания хлорофилла по спектрам поглощения нативных клеток Spirulina platensis // Вопросы современной альгологии. 2020. № 1 (22). С. 25–33. URL: http://algology.ru/1607

DOI - https://doi.org/10.33624/2311-0147-2020-1(22)-25–33

Уважаемые коллеги! Если Вы хотите получить версию статьи в формате PDF, пожалуйста, напишите в редакцию, и мы ее вам с удовольствием пришлем бесплатно. 
Адрес - info@algology.ru

При перепечатке ссылка на сайт обязательна

.

Estimation of chlorophyll content by absorption spectra of native Spirulina platensis cells 

Leonid E. Paramonov

Shirshov Institute of Oceanology RAS, Southern Branch (Gelendzhik, Russia)

A method for retrieving the absorption coefficients of Spirulina platensis pigments using absorption spectra of native cells and excluding the use of extracts is considered. Estimates of the intracellular concentration of chlorophyll a, С-phycoerythrin, С- phycocyanin and allophycocyanin in native cells are discussed.

Key words: spectrum of absorption coefficients; Spirulina platensis; chlorophyll a; С-phycocyanin; allophycocyanin; С-phycoerythrin.

Author

Paramonov Leonid E.

ORCID - https://orcid.org/0000-0002-8561-8197

Shirshov Institute of Oceanology RAS, Southern Branch, Russia, Gelendzhik

lparamonov@yandex.ru

References

1. Boussiba S., Richmond E. Isolation and characterization of phycocyanins from the blue-green alga Spirulina platensis. Arch. Microbiol. 1979. V.120. P.155–159.
2. Daemen E.A.M.J. Comparison of methods for the determination of chlorophyll in estuarine sediments. Netherlands Journal of Sea Research. 1986. V.20. P.21–28.
3. Duysens L.M.N. The flattening effect of the absorption spectra of suspensions as compared to that of solutions. Biochim. Biophys. Acta. 1956. V.19. P. 1–12.
4. Ficek D., Kaczmarek S., Ston-Egiert J., Wozniak B., Majchrowski R., Dera J. Spectra of light absorption by phytoplankton pigments in the Baltic: conclusions to be drawn from a Gaussian analysis of empirical data. Oceanologia. 2004. V.46. P. 533–555.
5. GOST 17.1.4.02-90. Voda. Metodika spektrometricheskogo opredeleniya khlorofila a. [Water. Spectrometric method of determination of chlorophyll a]. Izd-vo of standards, Moscow, 1999 (in Russ.).
6. Hoepffner N., Sathyendranath S. Effect of pigment composition on absorption properties of phytoplankton. Mar. Ecol. Prog. Ser. 1991. V.73. P. 11–23.
7. Kirk J.T.O. Light and Photosynthesis in Aquatic Ecosystems. Third edition. Cambridge: University Press. 2011. 509 p.
8. Koblenz-Mishke O.I., Vedernikov V.I. Produktsiya morskikh soobshchestv [Production of marine communities]. In: Pervichnaya produktsiya. Biologiya okeana. T.2. Biologicheskaya produktivnost’ okeana [Primary production. Biology of the ocean. V.2. Biological productivity of the ocean]. Nauka, Moscow, 1977. P. 183–209 (in Russ.)
9. Mineeva N.M. Rastitelnuye pigmentu kak pokazateli biomassu fitoplanktona [Plant pigments as indicators of phytoplankton biomass]. Algologiya. 2011. V.21. P. 385–395 (in Russ.)
10. Mordasova N.V. Kosvennaya ochenka produktivnosti vod po soderjaniyu khlorofila [Indirect assessment of water productivity by chlorophyll content]. Trudy VNIRO. 2014. V.152. P. 41–56 (in Russ.)
11. Morel A. Light and marine photosynthesis: a spectral model with geochemical and climatological implications. Prog. Oceanogr. 1991. V.26. P. 263–306.
12. Paramonov L.E. Ochenka spektrov pogloshcheniya diatomovykh vodoroslei na primere Chaetoceros protuberans [Estimation of absorption spectra of diatoms on the example of Chaetoceros protuberans]. Voprosy sovremennoi algologii [Issues of modern algology]. 2017. №1(13) URL:http://algology.ru/1094 (date – 25.10.2019) (in Russ.).
13. Paramonov L. E. Spektr pokazatelei poglosccheniya i vnutrikletochnaya kontsentratsiya pigmentov tsianobakterii na primere Spirulina platensis [Spectrum of absorption coefficients and intracellular concentration of cyanobacteria pigments on the example of Spirulina platensis]. Optika atmosferu i okeana. 2018. V.31. P. 103–108 (in Russ.)
14. Platt T., Sathyendranath S. Oceanic primary production: estimation by remote sensing at local and regional scales. Science. 1988. V.241. P. 1613–1620.
15. Sathyendranath S., Cota G., Stuart V., Maass H., Platt T. Remote sensing of phytoplankton pigments: a comparison of empirical and theoretical approaches. Int. J. Rem. Sens. 2001.V.22. P. 249–273.
16. SCOR-UNESCO Working Group Number 17. Determination of photosynthetic pigments. UNESCO Monographs in Oceanographic Methodology. 1966. N1. P. 9–18.
17. Shifrin K.S. Vvedenie v optiku okeana [Introduction to ocean optics]. Gidrometeoizdat, Leningrad. 1983. 278 p. (in Russ.)
18. Shifrin K.S., Tonna G. Prostaya formula dlya koefficienta pogloshcheniya slaboprelomlyaushchikh chastits [Simple formula for the absorption coefficient of weakly refracting particles]. Optika i spektroskopiya. 1992. V.72. P. 487–490 (in Russ.)
19. Simis S.G.H., Kauko H.M. In vivo mass-specific absorption spectra of phycobilipigments through selective bleaching. Limnol. Oceanogr.: Methods. 2012. V.10. P. 214–226.
20. Van de Hulst G. Rasseyaniye sveta malymi chastitsami. [Light scattering by small particles]. Izd-vo Inostr. lit-ry, Moscow, 1961. 536 p. (in Russ.)

ARTICLE LINK:

Paramonov L.E. Estimation of chlorophyll content by absorption spectra of native Spirulina platensis cells. Voprosy sovremennoi algologii (Issues of modern algology). 2020. № 1 (22). P. 25-33. URL: http://algology.ru/1607

DOI - https://doi.org/10.33624/2311-0147-2020-1(22)-25-33

Dear colleagues! If you want to receive the version of the article in PDF format, write to the editor,please and we send it to you with pleasure for free. 
Address - info@algology.ru

When reprinting a link to the site is required

На ГЛАВНУЮ

Карта сайта

К разделу ОБЗОРЫ, СТАТЬИ И КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ

КОНТАКТЫ

Email: info@algology.ru

Изготовление интернет сайта
5Dmedia

ЛИЦЕНЗИЯ

Эл N ФС 77-22222 от 01 ноября 2005г.

ISSN 2311-0147