Рефрактометрический экспресс-метод оценки состава культуральной среды микроводорослей

Refractometric express method of culture medium composition estimation

 

Тренкеншу Р.П., Горбунова С.Ю., Жондарева Я.Д.

Rudolf P. Trenkenshu, Svetlana Yu. Gorbunova, Yana D. Zhondareva

 

Институт морских биологических исследований им. А.О.Ковалевского (Севастополь, Россия)

 

УДК 681.785.2:582.232

 

Предложен экспресс-метод оценки изменений состава внеклеточной среды в культуре микроводорослей с помощью рефрактометра. На примере Arthrospira platensis показано, что клетки микроводорослей, вне зависимости от их концентрации в культуре, практически не оказывают влияния на показатель преломления. Значения показателя преломления существенно зависят от концентрации растворенных органических веществ в культуральной среде.

Ключевые слова: микроводоросли; оптическая плотность; показатель преломления; Arthrospira platensis; внеклеточная среда.

 

Введение

Спектрофотометрические измерения широко используются в практике изучения микроводорослей (Новикова, 2017; Парамонов, 2017). Но микроводоросли имеют интенсивную окраску из-за сильной пигментации клеток, что делает практически невозможным быстрое исследование неокрашенных околоклеточных сред. В связи с этим, чтобы отделить культуральную (внеклеточную) среду от клеток водорослей приходится производить дополнительные манипуляции с культурой.

Такого рода задачи важны в процессе изучения миксотрофного питания микроводорослей. Однако здесь возникает проблема быстрой оценки скорости поглощения клетками органического вещества, добавляемого в питательную среду в качестве источника энергетического и углеродного питания. С одной стороны, в опытах с Neochloris было показано, что заметное изменение концентрации меченой глюкозы происходит за минуты (Morales-Sanchez et al., 2013). С другой стороны, длительность адаптации многих видов микроводорослей при переходе на органический источник углерода может занимать несколько суток, после чего начинается бурный рост (Тренкеншу, Жондарева, 2017).

Не менее важным направлением работ с микроводорослями является изучение их экзометаболитов (Maheep, 2014), которые можно идентифицировать только после отделения клеток от культуральной среды. Аналогичные задачи приходится решать и при выращивании водорослей на сточных водах (Горбунова, Жондарева, 2017), т.к. об эффективности очистки загрязненных вод можно судить только после отделения культуральной среды от микроводорослей.

Предлагаемый оптический метод лишен этих недостатков, т.к. теоретически коэффициент преломления света на частицах (клетках микроводорослей), размер которых значительно больше, чем длина волны света, вносят лишь небольшую ошибку в измерения. Целью настоящей работы является экспериментальная оценка независимости рефракции от концентрации клеток микроводорослей, и зависимость показателя преломления культуры от концентрации веществ в околоклеточной среде. В работе приводятся результаты, подтверждающие возможность применения рефрактометрического метода в практике микроводорослевых исследований.

 

Материалы и методы

Работа проводилась в отделе биотехнологий и фиторесурсов ФГБУН ИМБИ РАН имени А.О. Ковалевского. Объектом исследования являлся штамм альгологически чистой культуры цианобактерии Arthrospira platensis (Nordst.) Geitler. (IMBR-31). Культуру выращивали на стандартной питательной среде Заррук (Zarrouk, 1966) в унифицированной лабораторной установке со стеклянными фотобиореакторами плоскопараллельного типа объёмом 3 литра, размерами 40×20×5 см с глубиной освещаемого слоя 5 см при круглосуточном освещении (Тренкеншу и др., 2017).

Для равномерного распределения питательных веществ между клетками культура непрерывно барботировалась. Температуру суспензии поддерживали в диапазоне 30–32°С.

Показатель преломления водных растворов культуры и супернатанта в зависимости от их концентрации измеряли с помощью рефрактометра ИРФ «Компакт» ЛИМО.414221.001. Данный прибор позволяет исследовать вещества с показателем преломления от 1,3 до 1,7. Для определения истинного коэффициента преломления раствора неизвестной концентрации предварительно проверяли правильность градуировки шкалы. Все измерения проводили при постоянной температуре растворов и прибора, которую четко поддерживали на уровне 20°С.

Параллельно с измерением коэффициента преломления измеряли оптическую плотность образцов с помощью фотоколориметра КФК-2, на светофильтре с длиной волны 750 нм. Измерения проводили в стеклянных кюветах с длиной рабочей стороны 0,5 см. Погрешность измерения не превышала 1,0%.

В качестве контроля использовали супернатант, соответствующий каждому из вариантов эксперимента. Для отделения клеток микроводорослей от супернатанта использовали центрифугу лабораторную ОПН-8 с радиусом ротора r=0,05 м и центрифужными пробирками l=0,062 м при 3000 об/мин, максимальный фактор разделения g=1,870.

 

Результаты и обсуждение

Для опытов была использована культура микроводорослей, достигшая при выращивании плотности 0,42 г/л в абсолютно сухом весе (АСВ). Образец культуры измеряли колориметрически и рефрактометрически, затем культуру разводили дистиллированной водой в 2, 3, 4, 5 и 6 раз и снова производили измерения. Результаты показаны на рис. 1. На рисунке хорошо видно, что с уменьшением плотности культуры при разведении ее водой оптические показатели одновременно снижаются. При этом следует отметить высокий коэффициент линейной корреляции.

Рис. 1. Зависимость оптических характеристик от плотности культуры Arthrospira platensis при ее разбавлении дистиллированной водой. Звездочками обозначены показатели преломления, кружочкамиоптическая плотность

Fig. 1. Dependence of the optical properties of Arthrospira platensis culture density by dilution with distilled water. Stars are marked with refraction indicators, circles-optical density

 

На рис. 2 показана связь показателя преломления с оптической плотностью культуры. На хороший уровень согласия с линейной моделью указывает высокий коэффициент детерминации (Coef of determination, R-squared = 0,986).

Рис. 2. Корреляционная связь между оптической плотностью и показателем преломления культуры Arthrospira platensis

Fig. 2. Correlation between optical density and refractive index of the Arthrospira platensis culture

 

Учитывая, что размер исследуемых клеток микроводорослей намного больше длины волны света, используемого в рефрактометре, при измерении показателя преломления сами клетки не должны влиять на показания прибора. Следовательно, показатель преломления определяется только околоклеточной средой. Чтобы убедиться в том, что клетки микроводорослей не оказывают существенного влияния на показатель преломления, был проведен опыт с добавлением клеток в супернатант. Для этого были приготовлены образцы с заданной плотностью культуры и с одинаковой околоклеточной средой.

Образцами для измерений служила культура A. platensis (плотность 0,42 г АСВ/л), предварительно разбавленная супернатантом. При этом использовался супернатант, полученный после центрифугирования и отделения клеток этой же культуры. Результаты показаны на рис. 3.

Рис. 3. Зависимость оптических характеристик от плотности культуры Arthrospira platensis при ее разбавлении супернатантом. Звездочками обозначены показатели преломления, кружочками – оптическая плотность

Fig. 3. Dependence of the optical properties from Arthrospira platensis culture density by dilution with supernatant. Stars are marked with indicators of refraction, circles-optical density

 

Чтобы изучить возможность использования рефрактометрического метода для культур высокой плотности (полностью поглощающей свет в тонком слое) и полностью исключить влияние внеклеточных веществ в образцах, были проведены измерения оптических характеристик при разбавлении свежей питательной средой отфильтрованных и промытых средой клеток. Результаты приведены на рис. 4.

 

 

Рис. 4. Зависимость оптических характеристик от плотности культуры A. platensis при ее разбавлении средой. Звездочками обозначены показатели преломления, кружочками – оптическая плотность.

Fig. 4. Dependence of optical properties on the culture density of A. platensis  diluted with media. . Refraction indexes are marked with stars, optical density – with circles. 

 

Как и следовало ожидать, показатель преломления света культурами микроводорослей в широком диапазоне плотностей (от 0,1 до 20 г АСВ/л) напрямую не зависит от концентрации клеток. Вместе с тем, он чувствителен к изменениям в околоклеточной среде клеток. Такие изменения могут быть связаны только с метаболизмом микроводорослей.

 

Заключение

Предложен рефрактометрический экспресс-метод оценки изменений состава культуральной среды в процессе выращивания микроводорослей. На примере культуры Arthrospira platensis показано, что клетки микроводорослей, вне зависимости от их концентрации, не оказывают прямого влияния на показатель преломления света. Таким образом, чтобы исследовать наличие или определить концентрации тех или иных веществ в культуральной среде в процессе выращивания микроводорослей, нет необходимости производить подготовительные манипуляции с подготовкой анализа культуры. При использовании рефрактометра возможно избежать дорогостоящего и зачастую трудоемкого процесса отделения биомассы от культуральной среды.

 

Работа выполнена по теме Госзадания ФГБУН ИМБИ № 1001-2014-0017.

 

Список литературы

1. Горбунова С.Ю., Жондарева Я.Д. Миксотрофное питание как пример экологически приемлемой технологии для культивирования цианобактерии  Arthrospira (Spirulina) platensis (Nordst) Geitler  // Вопросы современной альгологии. 2017. №2 (14). URL: http://algology.ru/1176

2. Новикова Т.М. Влияние средней поверхностной освещенности на ростовые характеристики Tetraselmis viridis // Вопросы современной альгологии. 2017. №1 (13). URL: http://algology.ru/1135

3. Парамонов Л.Е. Оценка спектров поглощения диатомовых водорослей на примере Chaetoceros protuberans // Вопросы современной альгологии. 2017. №1 (13). URL: http://algology.ru/1094

4. Тренкеншу Р.П., Жондарева Я.Д. Лаг-период культуры Phaeodactylum tricornutum Bohlin при переходе на гетеротрофный тип питания // Вопросы современной альгологии. 2017. №1 (13). URL: http://algology.ru/1141

5. Тренкеншу Р.П., Лелеков А.С., Боровков А.Б., Новикова Т.М. Унифицированная установка для лабораторных исследований микроводорослей // Вопросы современной альгологии. 2017. №1 (13). URL: http://algology.ru/1097

6. Maheep K. Harvesting of valuable eno- and exo-metabolites form cyanobacteria: A potential source // Asian J Pharm Clin Res. 2014. V.7. Suppl.1. P. 24–28.

7. Morales-Sanchez D., Tinoco-Valencia R., Kyndt J., Martinez A. Heterotrophic growth of Neochloris oleoabundans using glucose as a carbon source // Biotechnology for Biofuels. 2013. 6. P. 100.

8. Zarrouk C. Contribution a l’etude d’une cyanophycee. Influence de divers facteurs physiques et chimiques sur la crossance et la photosynthese de Spirulina maxima / C. Zarrouk // Ph.D. thesis. – Paris, 1966. – 138p.

Статья поступила в редакцию 10.12.2017

.

 

Refractometric express method of culture medium composition estimation

Rudolf P. Trenkenshu, Svetlana Yu. Gorbunova, Yana D. Zhondareva

Kovalevsky Institute of Marine Biological Research of RAS (Sevastopol, Russia)

An express-method aimed at estimating changes of composition of extracellular medium in the microalgae culture using a refractometer has been proposed. For Arthrospira platensis culture it has been shown that the microalgae cells independently of their concentration in the culture do not   have any influence on the refractive index while its values depend essentially on the concentration of dissolved organic matter in the culture medium.

Key words: microalgae; optical density; refractive index; Arthrospira platensis; extracellular medium.

 

 

Об авторах

Тренкеншу Рудольф Павлович – Trenkenshu Rudolf P.

кандидат биологических наук
ведущий научный сотрудник, заведующий Отделом биотехнологий и фиторесурсов Института морских биологических исследований им. А.О.Ковалевского РАН  (ФГБУН ИМБИ), г. Севастополь, Россия (Federal State Institution of Science «The A. O. Kovalevsky Institute of Marine Biological Research of RAS» IMBR, Sevastopol, Russia)

r.trenkenshu@rambler.ru

Горбунова Светлана Юрьевна - Gorbunova Svetlana Yu.

кандидат биологических наук
старший научный сотрудник, Институт морских биологических исследований им. А.О.Ковалевского РАН  (ФГБУН ИМБИ), г. Севастополь, Россия (Federal State Institution of Science «The A. O. Kovalevsky Institute of Marine Biological Research of RAS» IMBR, Sevastopol, Russia)

svetlana_8423@mail.ru

Жондарева Яна Дмитриевна – Zhondareva Yana D.

младший научный сотрудник, Институт морских биологических исследований им. А.О.Ковалевского РАН  (ФГБУН ИМБИ), г. Севастополь, Россия (Federal State Institution of Science «The A. O. Kovalevsky Institute of Marine Biological Research of RAS» IMBR, Sevastopol, Russia), Отдел биотехнологий и фиторесурсов.

yana.zhondareva@yandex.ru

Корреспондентский адрес: Россия, 299011, Севастополь, пр. Нахимова, 2, ФГБУН ИМБИ; тел. (869)-2550795.

 

 

ССЫЛКА НА СТАТЬЮ:

Тренкеншу Р.П., Горбунова С.Ю., Жондарева Я.Д. Рефрактометрический экспресс-метод оценки состава культуральной среды микроводорослей // Вопросы современной альгологии. 2018. № 1 (16). URL: http://algology.ru/1255

Уважаемые коллеги! Если Вы хотите получить версию статьи в формате PDF, пожалуйста, напишите в редакцию, и мы ее вам с удовольствием пришлем бесплатно. 
Адрес - info@algology.ru

При перепечатке ссылка на сайт обязательна

 

 

На ГЛАВНУЮ

Карта сайта

 

К разделу ОБЗОРЫ, СТАТЬИ И КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ

 

 








ГЛАВНАЯ

НОВОСТИ

О ЖУРНАЛЕ

АВТОРАМ

17 номеров журнала

ENGLISH SUMMARY

ОБЗОРЫ И СТАТЬИ

ТЕМАТИЧЕСКИЕ РАЗДЕЛЫ

УЧЕБНО-МЕТОДИЧЕСКИЕ
МАТЕРИАЛЫ


АКВАРИАЛЬНЫЕ СИСТЕМЫ
И  ИХ  СОДЕРЖАНИЕ


КОНФЕРЕНЦИИ

АЛЬГОЛОГИЧЕСКИЙ СЕМИНАР

СТУДЕНЧЕСКИЕ РАБОТЫ

АВТОРЕФЕРАТЫ

РЕЦЕНЗИИ


ПРИЛОЖЕНИЕ к журналу:


ОБЪЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

ОПРЕДЕЛИТЕЛИ И МОНОГРАФИИ

ОТЕЧЕСТВЕННАЯ АЛЬГОЛОГИЯ
СЕГОДНЯ


ИСТОРИЯ АЛЬГОЛОГИИ

КЛАССИКА
ОТЕЧЕСТВЕННОЙ АЛЬГОЛОГИИ


ПУБЛИКАЦИИ ПРОШЛЫХ ЛЕТ

ВЕДУЩИЕ АЛЬГОЛОГИЧЕСКИЕ
ЦЕНТРЫ


СЕКЦИЯ  АЛЬГОЛОГИИ  МОИП

НАУЧНО-ПОПУЛЯРНЫЙ РАЗДЕЛ

СЛОВАРИ И ТЕРМИНЫ



НАШИ ПАРТНЕРЫ


ПРЕМИИ

КОНТАКТЫ

Новые публикации



Карта сайта






Рассылки Subscribe.Ru
Журнал "Вопросы современной альгологии"
Подписаться письмом


Облако тегов:
микроводоросли    макроводоросли    пресноводные    морские    симбиотические_водоросли    почвенные    Desmidiales(отд.Сharophyta)    Chlorophyta    Rhodophyta    Conjugatophyceae(Zygnematophyceae)    Phaeophyceae    Диатомеи     Dinophyta    Prymnesiophyta_(Haptophyta)    Cyanophyta    Charophyceae    бентос    планктон    перифитон    кокколитофориды    Экология    Систематика    Флора_и_География    Культивирование    Химический_состав    Минеральное_питание    Ультраструктура    Загрязнение    Биоиндикация    Размножение    Морфогенез    Морфология_и_Морфометрия    Физиология    Морские_травы    Использование    ОПРЕДЕЛИТЕЛИ    Фотосинтез    Фитоценология    Черное_море    Белое_море    Баренцево_море    Карское_море    Дальний_Восток    Азовское_море    Каспийское_море    Чукотское_море    КОНФЕРЕНЦИИ    ПЕРСОНАЛИИ    ИСТОРИЯ    РЕЦЕНЗИЯ    Биотехнология    Динамические_модели    Экстремальные_экосистемы    Ископаемые_водоросли    Сезонные_изменения    Биоразнообразие    Аральское_море    первичная_продукция    Байкал    молекулярно-генетический_анализ    

КОНТАКТЫ

Email: info@algology.ru

Изготовление интернет сайта
5Dmedia

ЛИЦЕНЗИЯ

Эл N ФС 77-22222 от 01 ноября 2005г.

ISSN 2311-0147