|
 |
|
V Сабининские чтения 29 ноября 2016 - 29 января 2017 Цианобактерии альгологической коллекции Института физико-химических и биологических проблем почвоведения РАН (ACSSI)
Темралеева А.Д., Москаленко С.В. Anna D. Temraleeva, Svetlana V. Moskalenko
Институт физико-химических и биологических проблем почвоведения РАН (г. Пущино) УДК 582.232+58.006
В статье приведен список цианобактериальных штаммов альгологической коллекции ACSSI. Описанные штаммы были выделены из различных типов почв территории России и изучены с использованием морфологического и молекулярно-генетического анализа. Обсуждается морфологическая изменчивость цианобактерий рода Nostoc (на примере N. commune) в естественных и культуральных условиях и связанная с ней проблема его правильной идентификации. Ключевые слова: цианобактерии; идентификация; почва; коллекция; ACSSI.
В 2016 году в Институте физико-химических и биологических проблем почвоведения РАН на базе действующей рабочей альгологической коллекции А.Д.Темралеевой была организована Альгологическая коллекция ИФХиБПП РАН – Algal Collection of Soil Science Institute (ACSSI). Цель Коллекции заключается в сохранении и поддержании новых для науки или флоры, редких и сложных с таксономической точки зрения штаммов цианобактерий и водорослей, выделенных преимущественно из наземных экосистем России и других стран. Штаммы Коллекции являются не только объектами фундаментальной науки, но и применяются для решения прикладных биотехнологических задач. Фонд Коллекции обеспечивает научные работы в области биоразнообразия, систематики, экологии, филогении и биотехнологии почвенных цианобактерий и водорослей. Инициатором и руководителем Коллекции является к.б.н., с.н.с. А.Д. Темралеева, куратором – м.н.с. С.В. Москаленко. ACSSI зарегистрирована во Всемирной федерации коллекций культур (World Federation for Culture Collections, WFCC) под номером 1132 (http://www.wfcc.info/ccinfo/index.php/collection/by_id/1132/). В настоящее время в состав ACSSI входит 60 штаммов нитчатых цианобактерий, изолированных из различных типов фоновых почв: серой лесной, каштановой, луговой, бурой полупустынной, солонцов, а также лишайника Lobaria pulmonaria. Из них для 38 штаммов проведен морфологический и мультигенный анализ с помощью комплекса методов (табл. 1): 1. Культуральные микробиологические методы Для выделения максимального разнообразия цианобактерий из почвенных образцов мы используем вначале чашечные и водно-почвенные смешанные культуры, далее жидкие минеральные и органо-минеральные питательные среды BG11 с азотом и без, Bristol, Bold 3N, CyanoMedium с дальнейшим поверхностным и глубинным посевом на те же агаризованные среды. Очистка цианобактерий от сопутствующих контаминантов проводится с помощью изоляции единичных колоний и нитей пипеткой Пастера и микробиологической петлей, а также очистки антибиотиками и фунгицидами. Все депонированные в коллекцию цианобактериальные штаммы растут на среде BG11 с азотом и без (1%-ный агар, pH = 7.0) в климатостате (температура +23–25°С, освещенность люминесцентными лампами FLUORA 60–75 мкмоль фотонов ∙ м-2 ∙ с-1, фотопериод 12 ч). 2. Морфологический анализ Для первичной идентификации штаммов мы исследуем их морфологию и жизненные циклы методами световой микроскопии (светлое поле и интерференционный контраст) с помощью микроскопов Leica DM750 и Carl Zeiss Axio Scope A1 (Германия). Результаты наблюдений документируем рабочими рисунками и фотографиями, снятыми с помощью цветных цифровых камер «Видеозавр» (Россия) и Carl Zeiss MRc 5 (Германия). Сроки наблюдения составляют от 2 недель до 6 месяцев. При морфологической идентификации штаммов цианобактерий учитываем такие признаки как тип организации таллома; наличие истинного или ложного ветвления, слизистых оболочек, специализированных клеток (гетероцит, акинет); цвет, форма и размеры клеток; способы размножения и другие характеристики. Для видовой идентификации цианобактерий мы используем современные определители и избранные статьи (Komárek, Anagnostidis, 2005; The Freshwater…, 2011; Komárek, 2013; Komárek, 2014). Проверка таксономического положения цианобактерий проводится по Международной электронной базе данных AlgaeBase (Guiry, Guiry, 2016). 3. Молекулярно-генетический анализ Далее идентификация морфовидов подтверждается с помощью молекулярно-генетических методов. Данный анализ состоит из этапов выделения суммарной ДНК с помощью колонок (набор DNeasy Plant Mini Kit, Qiagen, США) или магнитных частиц (набор ФитоСорб, Синтол, Россия) по протоколам производителей; амплификация генов 16S рРНК, rbcL и nifH; детекция целевых ПЦР-продуктов с помощью электрофореза; очистка ампликонов из геля с помощью колонок (набор Cleanup Mini, Евроген, Россия) и секвенирование нуклеотидных последовательностей (на базе ЗАО «Синтол», Россия). Далее осуществляем поиск гомологии нуклеотидных последовательностей по алгоритму BLAST в GenBank, составляем наборы из собственных и депонированных в генетические базы данных последовательностей и проводим филогенетическую реконструкцию по выбранному гену с оценкой надежности топологии дерева. Несмотря на то, что ген 16S рРНК является самым популярным молекулярным маркером для бактерий, начиная с пионерной работы К. Везе (Woese et al., 1990) и ныне, из-за его консервативности все более признанным становится мультигенный анализ цианобактерий (Boyer et al., 2002; Seo, Yokota, 2003; Mazard et al., 2012; Mühlsteinova et al., 2014; Bohunická et al., 2015; и др.).
Таблица 1. Список штаммов цианобактерий коллекции ACSSI, Table 1. The list of cyanobacterial strains of ACSSI collection studied using morphological
По результатам исследования 31 штамм цианобактерий принадлежал порядку Nostocales, 5 штаммов – порядку Synechococcales и 2 штамма – порядку Oscillatorialles (рис. 1).
Рис. 1. Местообитание и таксономическая структура цианобактериальных штаммов ACSSI, изученных с помощью морфологического и мультигенного анализа.
Среди цианобактерий порядка Nostocales наиболее представлен был род Nostoc (20 штаммов) и Cylindrospermum (7), роды Tolypothrix, Anabaena, Trichormus и Hassallia имели по одному виду. Порядок Synechococcales включал в себя цианобактерии рода Nodosilinea (3 штамма), Phormidesmis (1) и Leptolyngbya (1). В порядок Oscillatorialles вошли 2 рода: Phormidium (1 штамм) и кандидат в новый род. При этом из серой лесной почвы Московской и Тульской областей было выделено максимальное количество штаммов цианобактерий – 15 (40%), все из них принадлежали порядку Nostocales. Из солонцов Волгоградской области было изолировано 8 штаммов цианобактерий (21%), относящихся к двум порядкам – Nostocales и Synechococcales. Из бурой полупустынной почвы республики Калмыкия было выделено 7 штаммов цианобактерий (18%) порядков Nostocales и Oscillatorialles. Пять (5) штаммов (13%) цианобактерий порядков Nostocales и Synechococcales было изолировано из каштановой почвы Волгоградской области; 2 штамма (5%), принадлежащих порядку Nostocales, было выделено из луговой почвы Волгоградской области. Кроме того, 1 штамм Nostoc sp. был изолирован из таллома лишайника Lobaria pulmonaria. Род Nostoc в Коллекции насчитывает 14 штаммов: N. punctiforme, N. commune, N. edaphicum, N. minutum и Nostoc sp. (рис. 2). Кроме того, 6 штаммов с Nostoc-подобной морфологией не вошли в кладу Nostoc sensu stricto по данным анализа генов 16S рРНК и rbcL (данные не представлены) и не могут относиться к истинным ностокам.
Рис. 2. Фотографии штаммов цианобактерий рода Nostoc коллекции ACSSI. Шкала 10 мкм. Fig 2. Micrographs of ACSSI strains of the cyanobacterial genus Nostoc. Scale bars, 10 μm.
По результатам исследования можно отметить, что точная идентификация цианобактерий рода Nostoc затруднительна из-за сложного жизненного цикла, морфологической изменчивости в природных и лабораторных условиях, отсутствия типовых аутентичных штаммов в альгологических коллекциях и референсных нуклеотидных последовательностей в генетических банках данных. Описанных морфологических диакритических признаков представителей рода (колониальный образ жизни, особый жизненный цикл и частое присутствие терминальных гетероцит) и изученных генотипов природных популяций и штаммов явно недостаточно для полного понимания систематики и филогении таксона, необходима его ревизия. Наиболее ярким примером вышесказанного могут послужить два штамма N. commune ACSSI 030 и 035 (рис. 3). В условиях природной среды данный вид формирует характерные плоско-распростертые слоевища почти черной окраски. При его культивировании в чашечной культуре на увлажненной почве под «стеклами обрастания» колонии имеют типичную морфологию с оливково-зелеными трихомами в желто-коричневой слизи. Однако при длительном культивировании на питательной среде BG11 (без азота) колониальная слизь становится бесцветной (рис. 3). Кроме того, начальная стадия жизненного цикла N. commune – формирование заростков/гормогониев и их рост – может быть неправильно идентифицирована как N. punctiforme.
Рис. 3. Фотографии цианобактерии Nostoc commune в естественных и культуральных условиях. Fig 3. Micrographs of Nostoc commune cyanobacterium in natural and cultural environments.
Диакритические морфологические признаки, разделяющие истинные ностоки от Nostoc-подобных штаммов, пока неясны. Из луговой почвы (Волгоградская обл.) были изолированы цианобактерии Anabaena cf. pirinica и Trichormus variabilis, из бурой полупустынной почвы – Hassallia cf. pseudoramosissima и Tolypothrix sp. (рис. 4).
Рис. 4. Фотографии штаммов цианобактерий родов Anabaena, Hassallia, Tolypothrix, Trichormus и Nostoc-подобных штаммов коллекции ACSSI. Шкала 10 мкм. Fig 4. Micrographs of cyanobacterial genera Anabaena, Hassallia, Tolypothrix, Trichormus, and Nostoc-like strains of ACSSI collection. Scale bars, 10 μm.
Представители рода Cylindrospermum были обнаружены исключительно в серой лесной почве Тульской и Московской областей, среди них идентифицированы виды C. muscicola, C. skujae и Cylindrospermum sp. (рис. 5).
Рис. 5. Фотографии штаммов цианобактерий родов Cylindrospermum, Leptolyngbya, Nodosilinea, Phormidium, Phormidesmis и кандидата в новый род коллекции ACSSI. Шкала 10 мкм. Fig 5. Micrographs of ACSSI strains of cyanobacterial genera Cylindrospermum, Leptolyngbya, Nodosilinea, Phormidium, Phormidesmis, and candidate for new genus. Scale bars, 10 μm.
Среди членов порядка Oscillatorialles особое внимание стоит обратить на штамм ACSSI 163, выделенный из бурой полупустынной почвы (рис. 5). По морфологии данный штамм близок к цианобактериям родов Coleofasciculus и Trichocoleus, но отличается неравномерным расположением тилакоидов, более широкими трихомами (до 5,6 мкм) и местообитанием в наземных экосистемах. Анализы 18S рРНК и rbcL подтвердили самостоятельность данного штамма и возможность его выделения в новый самостоятельный род (данные не показаны). Еще один представитель порядка Oscillatorialles – штамм ACSSI 165 – был изолирован из бурой полупустынной почвы и характеризовался следующими свойствами при росте на среде BG11 с азотом: отсутствие ветвления, газовых «вакуолей», гетероцит и акинет, наличие одного трихома в слизистом чехле шириной не более 10 мкм, клетки почти изодиаметрические, тилакоиды расположены радиально. Данный комплекс признаков позволил отнести штамм к роду Phormidium (рис. 5). Среди цианобактерий порядка Synechococcales были обнаружены первые в России находки вида Nodosilinea epilithica (Темралеева, Дронова, 2016). Сам род был описан недавно и насчитывает всего 4 вида (Perkerson et al., 2011), которые характеризуются уникальной способностью формировать узелки (нодулы/nodules), нитчатой организацией таллома, наличием тонкого, мягкого и бесцветного чехла, париетальным расположением тилакоидов. В коллекции имеется 3 штамма N. epilithica ACSSI 034, 166, 169 (рис. 5), два из которых были изолированы из каштановой почвы и один из солонца (Волгоградская обл.). Другой штамм порядка – ACSSI 171 – был изолирован из солонца (Волгоградская обл.) и идентифицирован как Leptolyngbya frigida с помощью морфологического и молекулярно-генетического анализов (рис. 5). Так как для описанных находок вида было характерным обитание в холодных, пресных, олиготрофных водах, обнаружение его в сухостепных почвах является подтверждением предположения о существовании нескольких экотипов вида. Еще один штамм – ACSSI 170, также выделенный из солонца (Волгоградская обл.), по данным морфологии и 16S рРНК-филогении относится к роду Phormidesmis, описанному в 2009 (Turicchia et al., 2009). Нити агрегированы в кластеры, с бесцветными слизистыми чехлами, слегка скрученные, клетки узкие, четковидные (рис. 5). Информация о 38 штаммах цианобактерий ACSSI, изученных с помощью морфологического и мультигенного анализа, представлена на сайте Коллекции: http://acssi.org/. Каждая запись сопровождается информацией об авторе, месте и дате изоляции штамма, морфологическим описанием, фотографиями и молекулярными данными, ссылками на литературу. Кроме того, в Глобальной Информационной Системе по Биоразнообразию (GBIF) на основе полученных в Проекте данных был депонирован датасет «Cyanobacteria (Cyanophyceae) of Algal Collection of Soil Science Institute (ACSSI)» (Temraleeva, 2016).
Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ в рамках научного проекта № 16-34-60020 мол_а_дк.
Список литературы 1. Сайт Альгологической коллекции ИФХиБПП РАН – Algal Collection of Soil Science Institute (ACSSI). URL: http://acssi.org (дата обращения: 20.12.2016). 2. Темралеева А.Д., Дронова С.А. Первая находка почвенной цианобактерии Nodosilinea epilithica на территории России // Новости систематики низших растений. 2016. Т. 50. С. 125–141. 3. Bohunická M., Pietrasiak N., Johansen J.R., Gómez E.B., Hauer T., Gaysina L.A., Lukešová A. Roholtiella, gen. nov. (Nostocales, Cyanobacteria) – a tapering and branching cyanobacteria of the family Nostocaceae // Phytotaxa. 2015. V.197, №2. P. 84–103. 4. Boyer S.L., Johansen J.R., Flechtner V.R., Howard G.L. Phylogeny and genetic variance in terrestrial Microcoleus (Cyanophyceae) species based on sequence analysis of the 16S rRNA gene and associated 16S–23S ITS region // J. Phycol. 2002. V.38, iss.6. P. 1222–1235. 5. Guiry M.D., Guiry G.M. AlgaeBase. World-wide electronic publication, National University of Ireland, Galway, 2016. http://www.algaebase.org (дата обращения: 20.12.2016). 6. Komárek J., Anagnostidis K. Cyanoprokaryota 2. Oscillatoriales // Büdel B., Krienitz L., Gärtner G., SchHagerl M. (eds). Süsswasserflora von Mitteleuropa 19/2. – Heidelberg: Elsevier/Spektrum, 2005. – 759 p. 7. Komárek J. Cyanoprokaryota. 3. Heterocytous genera // Büdel B., Gärtner G., Krienitz L., Schager M. (eds). Süßwasserflora von Mitteleuropa. Freshwater flora of Central Europe. – Springer Spektrum Berlin, Heidelberg. 2013. – 1130 p. 8. Komárek J., Kaštovský J., Mareš J., Johansen J.R. Taxonomic classification of cyanoprokaryotes (cyanobacterial genera) 2014, using a polyphasic approach // Preslia. 2014. V.86. P. 295–335. 9. Mazard S., Ostrowski M., Partensky F., Scanlan D.J. Multi-locus sequence analysis, taxonomic resolution and biogeography of marine Synechococcus // Environ. Microbiol. 2012. V.14. P. 372–386. 10. Mühlsteinova R., Johansen J.R., Pietrasiak N., Martin M.P., Osorio-Santos K., Warren S.D. Polyphasic characterization of Trichocoleus desertorum sp. nov. (Pseudanabaenales, Cyanobacteria) from desert soils and phylogenetic placement of the genus Trichocoleus // Phytotaxa. 2014. V.193. P. 241–261. 11. Perkerson R.B. III, Johansen J.R, Kovacik L., Brand J., Kastovsky J., Casamatta D.A. A unique pseudanabaenalean (cyanobacteria) genus Nodosilinea gen. nov. based on morphological and molecular data // J Phycol. 2011. V.47, iss.6. P. 1397–1412. 12. Seo P.S., Yokota A. The phylogenetic relationships of cyanobacteria inferred from 16S rRNA, gyrB, rpoC1 and rpoD1 gene sequences // J. Gen. Appl. Microbiol. 2003. V.49, iss.3. P. 191–203. 13. Temraleeva A. Cyanobacteria of Algal Collection of Soil Science Institute (ACSSI). v1.2. Institute of physicochemical and biological problems in soil science of the Russian Academy of Sciences. 2016. Dataset/Occurrence. http://gbif.ru:8080/ipt/resource?r=cyano&v=1.2 (дата обращения 2.12.2016) 14. The freshwater algal flora of the British Isles: an identification Guide to freshwater and terrestrial algae. – New York, 2011. – 878 p. 15. Turicchia S., Ventura S., Komarkova J., Komarek J. Taxonomic evaluation of cyanobacterial microflora from alkaline marshes of northern Belize. 2. Diversity of oscillatorialean genera // Nova Hedwigia. 2009. V.89. P. 165–200. 16. Woese C.R., Kandler O., Wheelis M.L. Toward a natural system of organisms: proposal for the domains Archaea, Bacteria, and Eucarya // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990. V.87. P. 4576–4579. Статья поступила в редакцию 20.12.2016
Cyanobacteria of Algal Collection of Soil Science Institute (ACSSI) Anna D. Temraleeva, Svetlana V. Moskalenko The list of cyanobacterial strains of algological collection ACSSI is reported. The described strains were isolated from different types of Russian soils and studied using morphological and molecular genetic analysis. We discuss the morphological variability of cyanobacterial genus Nostoc (on the example of N. commune) in natural and cultural environment and the related problem of its proper identification. Key words: cyanobacteria; identification; soil; collection; ACSSI.
Об авторах Темралеева Анна Дисенгалиевна - Temraleeva Anna D. кандидат биологических наук
Москаленко Светлана Валентиновна - Moskalenko Svetlana V. научный сотрудник Института физико-химических и биологических проблем почвоведения РАН, Пущино, Россия, (Institute of Physicochemical and Biological Problems in Soil Science of Russian Academy of Sciences, Russian Federation, Pushchino), лаборатория физико-химии почв
Корреспондентский адрес: Россия, 142290, Московская область, г. Пущино, ул. Институтская, д. 2, ИФХиБПП РАН; телефон: 8(4967)31-81-52.
ССЫЛКА НА СТАТЬЮ: Темралеева А.Д., Москаленко С.В. Цианобактерии альгологической коллекции Института физико-химических и биологических проблем почвоведения РАН (ACSSI) // Вопросы современной альгологии. 2017. № 1 (13). URL: http://algology.ru/1084 Уважаемые коллеги! Если Вы хотите получить версию статьи в формате PDF, пожалуйста, напишите в редакцию, и мы ее вам с удовольствием пришлем бесплатно.
При перепечатке ссылка на сайт обязательна
К разделу ОБЗОРЫ, СТАТЬИ И КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ
|
|
|
 | | ||
|
| ||
